Пипетирование и дозирование

Удаление жидкостей. Жидкости удаляют простой пипеткой, но процесс будет значительно облегчен и ускорен, если использовать пипетку с широким отверстием, присоединенную к вакуумному насосу или вакуумной линии. Требуется также подходящая емкость для слива и предупреждения загрязнения насоса. Можно использовать и простой перистальтический насос, перекачивающий жидкость в резервуар с дезинфектантом.

Пипетирующие устройства. Простое пипетирование является одной из наиболее частых повседневных манипуляций с культурами. Хотя резиновая груша или другие простые приспособления для пипетирования дешевы и просты в использовании, скорость, точность и воспроизводимость результатов значительно повышаются при использовании автоматического пипетиру-ющего устройства (дозатора), которые могут быть со встроенным или отдельным насосом, иметь питание от сети или от зарядного устройства. При выборе пипетирующего устройства обратите внимание на вес и удобство в использовании в течение долгого времени и лучше всего опробуйте одно из устройств прежде, чем приобретать его. Пипетирующие устройства обычно снабжены фильтром во вкладыше для минимизации переноса загрязнений. Некоторые фильтры одноразовые, некоторые можно использовать повторно после стерилизации.

Пипетирующее устройство. Моторизованное пипетирующее устройство для использования обычной градуированной пипетки

Автоматические пипетки. Эти устройства получили свое начало от микропипеток компании Eppendorf и использовались для дозирования объемов 10–200 мкл. К настоящему времени рабочие объемы возросли до 5 мл, поэтому термин «микропипетки» не всегда соответствует реальности, и это устройство называется по-разному: дозатор, автоматическая пипетка, пипетман и т.п. Только наконечники этих пипеток нуждаются в стерилизации, среди ограничений в использовании автоматических пипеток — длина наконечников, определяющая выбор используемых сосудов. Если стерильная жидкость забирается из контейнера с помощью автоматической пипетки, ее нестерильный корпус не должен касаться сторон контейнера. Реагенты объемом 10–20 мл могут быть дозированы на объемы от 5 мкл до 1 мл из универсального контейнера или на объемы 1–200 мкл из миниатюрного флакона. Для дозирования на объемы 100 мкл—1 мл можно использовать пробирки типа Ерpendorf, но они требуют стерилизации.

Предполагается, что внутри автоматическая пипетка стерильна либо не производит перемещения воздуха, достаточного для заражения наконечников. Однако в некоторых ситуациях даже минимальная возможность заражения имеет значение. Например, если вы осуществляете серийное субкультивирование ростковой клеточной линии (в противоположность кратковременному эксперименту с клетками, которые в конечном счете будут взяты на анализ либо уничтожены, но не предполагают их размножение), безопасность и чистота клеточной линии становятся первостепенными, поэтому вы должны использовать либо обычные стеклянные пипетки с ватным фильтром, либо одноразовые пипетки, которые стерильны по всей длине, что является существенным при необходимости достичь необходимой точки в сосуде, из которой отбираются пробы. Если вы используете достаточно маленькие контейнеры, то можно избежать прикосновения нестерильных частей корпуса автоматической пипетки, поэтому ее использование допустимо при условии, что наконечник снабжен фильтром, препятствующим перекрестному заражению и минимизирующим микробную контаминацию. В противном случае вы рискуете получить микробное загрязнение от нестерильных частей автоматической пипетки или, что более значимо, перекрестное заражение из аэрозоля и жидкости, заброшенных в ствол этой пипетки.

Автоматическая пипетка (пипеттор). Пипетирующее устройство с изменяемым объемом, Существуют также пипетки с фиксированным объемом. Сами пипетки не стерилизуют, пластиковые наконечники подвергают стерилизации

Обычное субкультивирование, которое должно проводиться быстро и точно, с высокой степенью защиты от загрязнения и перекрестной контаминации, следует проводить с использованием стеклянных или одноразовых пластиковых пипеток. Экспериментальная работа, которая должна быть точной, но не требует длительного размножения используемых клеток, позволяет использовать автоматические пипетки.

Наконечники можно покупать россыпью в больших упаковках, с тем чтобы упаковывать и стерилизовать их в условиях лаборатории. Их можно также покупать уже стерильными и готовыми к использованию. Предварительно упакованные наконечники намного удобнее, но значительно дороже. Некоторые держатели для наконечников могут повторно стерилизоваться, что представляет собой определенный компромисс.

Диспенсеры больших объемов. Когда объем среды в культуральных сосудах превышает 100 мл, для разлива жидкостей можно использовать другие приспособления. Если используется небольшое количество сосудов, удобно применять пипетки объемом 100 мл (BD Bioscences) либо градуированные бутыли или пакеты (Sigma). Если объемы очень большие (около 500 мл) либо требуется очень большое количество повторного отмеривания больших объемов, может понадобиться перистальтический насос. Простой перенос большого объема жидкости (10–10 000 л) обычно осуществляется приготовлением среды в закупоренном под давлением сосуде и дальнейшим перемещением ее в культуральные сосуды под действием положительного давления (Alfa Laval). Можно разливать большие объемы путем простого переливания через горлышко сосуда, однако такого рода манипуляции ограничиваются однократным действием с предварительным измерением объема переливаемой жидкости.

Градуированный бутылочный диспенсер. Пробка с двумя отверстиями вставлена в горлышко градуированной бутыли, от одного отверстия отведен шланг, соединенный с диспенсирующим колоколом, защищающий принимающий жидкость сосуд. На шланге имеется металлический пружинный зажим, имеется также отводящая линия для равновесия воздуха. Пробка может стерилизоваться отдельно от бутылки, подходит к любой стандартной бутылке со средой. (Оригинальное изобретение John Paul.)

Многократное диспенсирование. Традиционно диспенсер для многократного повторяющегося дис-пенсирования представляет собой тип оборудования, известный как шприц Корнуэла, в котором жидкость набирается через одно отверстие, а выпускается через другое, при этом используется простой двухходовой клапан. Пружинный поршень шприца делает процедуру полуавтоматической и многократной. Существует неисчислимое количество вариантов такого типа диспенсеров, многие из которых применяются в настоящее время. Основные проблемы при их использовании возникают из-за залипания поршня, но его можно минимизировать, если избегать этапа сушки после автоклавирования и прокаливания шприца со средой или солевым раствором до и после использования. Многократное диспенсирование небольших объемов осуществляют пошаговым движением поршня в шприце.

Перистальтический насос также может использоваться для диспенсирования серийных емкостей и имеет определенные преимущества, так как наличие у него ножной педали позволяет оставлять руки свободными. Использование такого оборудования требует особенно тщательной заботы о чистоте диспенсирования и предупреждения загрязнений трубок на приемном и выпускном концах. В общем, применение такого оборудования целесообразно, если требуется разлить очень большое число флаконов. Автоматическое пипетирование, обеспечиваемое перистальтическим насосом, может быть контролируемо в малых приращениях. Кроме того, необходимо автоклавировать только приносящие трубки. При разливе объемов от 10 до 100 мл точность и воспроизводимость могут находиться на достаточно высоком уровне. Некоторые виды приводящих трубок можно стерилизовать и хранить в инвентаре, что позволяет быстро заменить их при случайном загрязнении или смене клеточного типа или разливаемого реагента.

Пипетка с многократно дозируемым объемом. Пошаговый диспенсер действует на основе движения помпового механизма в шприце, который приводится в движение кнопкой, на которую нажимают большим пальцем (Jencons)

Автоматический диспенсер. Диспенсер Perimatic Premier, пригодный для многократного диспенсирования и разлива в диапазоне 1–1000 мл. Если оборудование используется для стерильных операций, следует автоклавировать только доставляющие трубки

Автоматизация. В культивировании тканей было много попыток автоматизировать процесс разлива жидкостей, но только некоторые системы нашли широкое практическое применение. При стандартной системе производства может использоваться автоматическое снабжение растворами, однако большие затраты времени на настройку соответствующей программы и внесение модификаций, которые могут потребоваться при изменении системы, а также чрезвычайная важность соблюдения стерильности удерживают большинство лабораторий от инвестирования средств и времени во внедрение таких систем. Появление и широкое применение планшета для микротитрации принесло с собой автоматизацию разлива по ячейкам, учета результатов и т.д. Передаточные устройства, использующие перфорированные лотки, или многоканальные пипетки облегчают пересев из одной плашки в другую. Существуют также миксеры для планшетов и держатели для центрифугирования плашек. Ассортимент оборудования столь широк, что не может быть приведен здесь, рекомендуем ознакомиться с соответствующими торговыми каталогами. Два вида оборудования заслуживают особого внимания: программируемая одноканальная или мультиканальная автоматическая пипетка Rainin и оборудование для переноса среды и реплицирования плашек Corning Coster Transtar. В технику исследований при помощи культивирования тканей сейчас вводятся роботизированные системы (такие как Packard), что является естественным продолжением микротитрационных систем. Роботы полностью автоматизируют процессы, хотя требуют перепрограммирования при изменении условий аналитических исследований.

Выбор системы. Выбор между оборудованием с ручным управлением и сложной автоматизированной системой определяют пять критериев:

  1. Легкость использования и эргономическая эффективность.
  2. Стоимость в соотношении с экономией времени и возрастанием эффективности.
  3. Точность и воспроизводимость в серийных и параллельных партиях.
  4. Легкость стерилизации и действие ее на точность и воспроизводимость.
  5. Механическая, электрическая, химическая, биологическая и радиологическая безопасность.

Требование безопасности. Большинство пипетирующих устройств склонны выпускать жидкость с более высокой скоростью, чем при нормальных ручных манипуляциях, и, следовательно, больше способствуют созданию аэрозолей. Это следует иметь в виду при использовании потенциально опасных биологических веществ.