Клеточные культуры
Эволюция клеточных линий
После первого субкультивирования (или пассажа) (см. рис. «Развитие клеточной линии») первичная культура начинает именоваться клеточной линией и может поддерживаться, размножаться и пассироваться несколько раз. При каждом успешном пассаже составляющая популяции с наиболее высокой скоростью пролиферации начинает доминировать и постепенно вытесняет другие компоненты популяции, обладающие меньшей пролиферативной активностью. Это особенно заметно после первого субкультивирования, при котором различия к возможности пролиферации усиливаются различной устойчивостью клеток к механическому воздействию либо трипсинизации, а также переносу в другие условия культивирования.
Развитие клеточной линии. Вертикальная ось (Y) представляет общий рост числа клеток в гипотетической клеточной культуре (предполагается, что при пересадке уменьшения количества клеток не происходит). Общее количество клеток (клеточный выход) представлен на этой оси в логарифмической шкале. Время культивирования показано на оси X в линейной шкале. Хотя постоянная клеточная линия изображена развивающейся в течение 14 недель, для различных клеточных линий это время подъема различно. Соответственно, старение может начаться в разное время, для человеческих диплоидных фибробластов старение происходит между 30-м и 60-м периодами удвоения количества клеток, или между 10-й и 20-й неделями, в зависимости от времени удвоения. Используемые термины и определения даны в словаре употребляемых терминов (по Hayflick & Moorhead [1961].)
Хотя некоторые селективные и фенотипические изменения будут продолжаться в ходе субкультивирования после третьего пассажа клеточная линия становится более стабильной и определяется устойчивыми к внешним воздействиям, быстро делящимися клетками. В присутствии сыворотки и без специфических селективных условий часто отмечается избыточный рост мезенхимальных клеток, имеющих в основе своего происхождения фибробласты соединительной ткани либо сосудистые элементы. Это явление способствовало появлению очень полезных для некоторых целей клеточных линий: легочные фибробласты человеческого эмбриона WI-38 [Hayflick and Moorhead, 1961], почечные фибробласты детенышей хомяков ВНК21 [Macpherson and Stoker, 1962], клетки COS [Gluzman, 1981], клетки CHO [Puck et al., 1958], и наиболее известные L-клетки, мышиные подкожные фибробласты, обработанные метилхолантреном [Earle et al., 1943, Sanford et al., 1948]. Однако в целом избыточный рост является одной из сложнейших проблем культивирования тканей, а именно: как предупредить избыточный рост при культивировании более нежных и медленно растущих специализированных клеток, таких как клетки печеночной паренхимы или эпидермальные кератиноциты. Чаще всего причину избыточного роста видят в неадекватности условий культивирования. В области подбора селективных сред и субстратов для поддержания многих клеточных линий достигнуты значительные успехи.
Старение
Нормальные клетки могут делиться ограниченное число раз; следовательно, клеточные линии, полученные из нормальной ткани, погибнут после фиксированного количества периодов удвоения популяции. Это генетически детерминированное событие включает участие нескольких различных генов и известно как старение культуры. Считается, что оно определяется, в частности, неспособностью терминальной последовательности ДНК в теломерах реплицироваться при каждом делении клетки. В результате происходит прогрессирующее укорочение теломеров, и в конце концов клетка становится неспособной к дальнейшему делению [Bodnar et al., 1998]. Исключениями из этого правила являются половые клетки, стволовые клетки и трансформированные клетки, которые часто экспрессируют фермент теломеразу, способный к репликации терминальных последовательностей ДНК в теломере и удлиняющий время жизни клеточной популяции, иногда бесконечно, — в случае половых клеток и некоторых опухолевых клеток.