Дифференцировка

Выражение особенностей дифференцировки клеточной культуры часто ограничено продвижением клеток по клеточному циклу, необходимому для размножения клеток и расширения ростковой культуры. Условиями, необходимыми для индукции дифференцировки, являются высокая плотность клеток, усиление межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий и присутствие различных факторов дифференцировки, которые могут быть антагонистами факторов клеточной пролиферации и наоборот. Поэтому, если есть необходимость дифференцировки культуры, следует различать две группы условий — одну, оптимизирующую клеточное деление, и другую, оптимизирующую клеточную дифференцировку.

Поддержание и индукция дифференцировки

Много лет назад было обнаружено, что специфические функции клеток сохраняются дольше, когда сохранена трехмерная структура первичной ткани, как в случае органной культуры. К сожалению, органная культура не может поддерживаться и перевиваться, поэтому для каждого следующего эксперимента требуется приготовление органной культуры de novo, что приводит к сложностям при стандартизации и количественном анализе данных. Восстановление трехмерности пространственной структуры возможно перфузией монослойной культуры или культивированием клеток на или в специальных матрицах, таких как коллагеновый гель, целлюлоза, желатиновая губка и др., в зависимости от конкретных потребностей исследователя. Ряд коммерческих продуктов, наиболее известным из которых является Matrigel (BD Biosciences), воспроизводит характеристики внеклеточного матрикса, которые не определены с необходимой точностью. Однако имеются варианты коммерческих препаратов, из которых удалены факторы роста (GFR-Matrigel). Эта технология имеет определенные ограничения, но предоставляет возможность для исследований межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий как гомотипической, так и гетеротипической культуры. В перспективе она также предполагает возможность изучения тканеспецифических функций, особенно когда взаимодействие клеток в культуре связано с ростом культуры в фильтрационной лунке. Для проявления фенотипических свойств дифференцированной культуры может потребоваться использование соответствующих селективных сред с соответствующими растворимыми индукторами. Такими индукторами могут быть гидрокортизон, ретиноиды или двухмерные полярные соединения. При этом обычно не требуется добавления сыворотки.

Развитие методов моделирования нормальных функций тканей в культуре может способствовать исследованиям патологических изменений, таких как демиелинизация и злокачественная инвазия. Однако с точки зрения фундаментальных исследований клетки, изучаемые in vitro, должны обладать всеми функциями, характерными для исходной ткани. Проявление дифференцированного фенотипа клеток не должно быть завершенным, поскольку появление единичного типоспецифического поверхностного антигена бывает достаточным для того, чтобы придать клетке правильное направление дифференцировки. Более полная экспрессия антигенов может потребоваться для того, чтобы поместить клетку в правильное положение в линиях клеточной дифференцировки и использовать ее как достоверную модель для исследования свойств клеток in vivo.

Дедифференцировка

Исторически в неспособности клеточных линий проявлять фенотипические признаки, которыми они обладают in vivo, обвиняли явление дедифференцировки. Согласно этой концепции, дифференцированные клетки при их культивировании in vitro теряют свои характерные свойства. Однако часто остается неясным, что вызвало адаптивную и потенциально обратимую утрату характерных для дифференцированных клеток свойств: 1) ошибки в выделении линии клеток; 2) выделение недифференцированных клеток желаемой линии, дающих избыточный рост по сравнению с полностью дифференцированными клетками, обладающими пониженной способностью к делению или 3) отсутствие соответствующих индукторов дифференцировки (гормонов или цитокинов межклеточного или клеточно-матриксного взаимодействия). В реальной практике все эти элементы могут вносить определенный вклад в дедифференцировку клеток. Даже при соблюдении адекватных условий культивирования и тщательной селекции клеток продолжительная пролиферация создает благоприятные условия для развития и деления недифференцированных клеток-предшественников, которые в отсутствие соответствующего окружения не переходят в стадию дифференцировки.

Дифференцировка из стволовых клеток

Дифференцировка из стволовых клеток, (a) In vivo. Небольшое количество стволовых клеток дает начало пулу пролиферирующих клеток-предшественников. (б) In vitro дифференцировка ограничена необходимостью пролиферации. Популяция состоит преимущественно из клеток-предшественников, хотя в популяции могут быть также представлены стволовые клетки. Плюрипотентные стволовые клетки (крайние слева) также могут быть выделены из некоторых тканей и культивированы, однако их отношения с тканевыми стволовыми клетками еще не ясны. Условия культивирования главным образом, определяют селекцию пролиферирующих клеток-предшественников данной ткани или индуцируют деление частично дифференцированных клеток, с последующим их преобразованием до состояния предшественников

Следует различать дедифференцировку, деадаптацию и селекцию. Понятие «дедифференцировка» подразумевает, что свойства специализированных клеток утрачены в результате конверсии до более примитивного фенотипа. Например, гепатоциты утратили бы характерные ферменты (аргиназа, аминотрансферазы и т. д.) и не могли бы накапливать гликоген или секретировать сывороточные белки в результате возвращения к состоянию клеток-предшественников [Kondo & Raff, 2004]. Деадаптация, в свою очередь, предполагает, что синтез специфических продуктов или иные аспекты специализированных функций клеток находятся под регуляторным контролем гормонов, влияния межклеточного и клеточно-матриксного взаимодействия и т. д., и может быть вновь индуцирован наличием соответствующих условий. Например, присутствие матрикса в виде плавающего коллагенового плотика [Michalopoulos & Pitit, 1975], Matrigel [Bissell et all., 1987] или диметилсульфоксида (DMSO) [Cable & Isom, 1997] позволяет сохранить дифференцированные свойства гепатоцитов. В настоящее время считается доказанным, что при наличии специальных условий культивирования дифференцированные фенотипические свойства клеток могут восстанавливаться.